作者：宋晓冬 杨成 刘孟安 孙丰润 刘颖 张丽霞 刘文波
【摘要】 目的 通过测定体外培养的SD大鼠胃肠平滑肌细胞内游离Ca2+浓度，观察胃肠舒对SD大鼠胃肠平滑肌细胞内游离Ca2+浓度的影响，探讨胃肠舒促胃肠动力的作用机制。方法 离体培养SD大鼠胃肠平滑肌细胞，应用特异性Ca2+荧光探针Fura-2AM负载细胞，激光共聚焦显微镜检测游离Ca2+浓度。结果 胃肠舒在25、50、100 mg/ml 时均可升高胃肠平滑肌游离Ca2+浓度，且随剂量增加而加强。结论 胃肠舒具有升高胃肠平滑肌细胞游离Ca2＋的作用，Ca2+作为细胞内第二信使可能参与了胃肠舒促进胃肠平滑肌细胞的动力机制。
【关键词】 胃肠舒；胃肠平滑肌细胞；Ca2+浓度 ；Fura-2AM；激光共聚焦显微镜
【Abstract】 Objective To observe Weichangshu on free Ca2+ concentration in gastrointestinal smooth muscle cell and explore its mechanism through determining free ［Ca2+］i concentration in rat gastrointestinal smooth muscle ods SD rat gastrointestinal smooth muscle cells were cultured and loaded with Fura-2AM.［Ca2+］i was measured by fluorescent intensity in each group cell with laser scanning confocal microscope. Results 25, 50, 100 mg/ml Weichangshu could elevate ［Ca２＋］i in gastrointestinal smooth muscle. The level of ［Ca２＋］i acted in dose-dependent. Conclusion The data indicated Weichangshu could increase ［Ca２＋］i in gastrointestinal smooth muscle cells. Ca２＋ as an intracellular second messenger, might be involved in the mechanism by which Weichangshu promoted the motility of gastrointestinal smooth muscle cells.
【Key words】 Weichangshu,gastrointestinal smooth muscle cells,［Ca２＋］i,Fura-2AM,laser scanning confocal microscope
胃肠运动障碍型疾病是临床多发病，多与胃肠蠕动功能减弱有关，是一类无法用解剖结构异常来解释的临床疾病，其主要病理生理基础为胃排空延迟及小肠传输功能障碍［１,２］，现临床最常用的促胃肠动力药促进胃肠蠕动虽然有较好疗效，但其副作用如药理作用受限、催乳素增加、焦虑、激动、运动性不安、共济失调、腹泻、腹痛等不可忽视。目前胃肠运动障碍型疾病由于发病机制尚不清楚［3,4］，其药物的研发受到限制，因此研究该类疾病的调控机制，为开发中药新药提供科学的数据非常重要［5］。
胃肠舒是本课题组研究人员根据《伤寒论》大承气汤、小承气汤、调胃承气汤三方化裁，取大黄、枳壳、甘草组方，经临床反复药物筛选研制而成的纯中药制剂，可起到有效促进胃肠动力的作用［6,7］。本研究选取SD大鼠胃肠组织进行原代细胞培养，构建胃肠平滑肌细胞模型，不同浓度的胃肠舒作用后，测定用药后胃肠平滑肌细胞内游离Ca2+浓度的变化，初步探讨了胃肠舒促进胃肠动力的分子机制。
1 材料与方法
1.1 材料 胃肠舒由滨州医学院附属医院制剂室提供；西沙必利由浙江京新药业股份有限公司生产；标准SD大白鼠由烟台绿叶实验动物中心提供；DMEM培养基购自GiBco公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料公司；Fura-2AM Ca2+荧光探针购自碧云天生物技术研究所；牛血清白蛋白购自碧云天生物技术研究所；HERA CO2培养箱；TCS SPE 激光扫描共聚焦显微镜。
1.2 方法
1.2.1 离体胃肠平滑肌细胞的培养：选择标准SD大白鼠，体质量180～200 g，雌雄各半，乙醚麻醉，剖腹后迅速剪取胃体、空肠组织，PBS清洗后剪碎，去除上清液，重复清洗2～3次。将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液，加入0.25％胰蛋白酶，在4 ℃孵育6～18 h。移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37 ℃孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30 min。待小块组织完全消化溶解后，过200目网，1 000 r/min离心7 min。弃上清液，向细胞沉淀中加入新鲜配制含20%胎牛血清的DMEM培养液，轻轻吹打，后按每瓶(25 ml)3×104活细胞接种在培养瓶里，放入37°C孵箱里静置培养待测，CK×41倒置相差显微镜观察拍照。
1.2.2 平滑肌细胞的鉴定：将处理好的盖玻片，放入6孔板使之与孔底贴合紧密，进行细胞培养。细胞生长至第5代吸去培养液，先用PBS洗涤已贴壁盖玻片2～3次。95%酒精室温固定20 min，PBS洗2～3次。0.1% TritonX-100室温孵育20～30 min增强细胞通透性。正常羊血清于37℃封闭20 min。滴加一抗兔抗鼠α-actin单克隆抗体（1∶200，购自Sigma公司）室温过夜，滴加二抗羊抗兔FITC-IgG（1∶100），37 ℃孵育2 h，倒置荧光显微镜（波长500 nm）观察拍照。
1.2.3 胞内钙离子浓度测定：实验分为5组，分别为空白对照组、西沙必利对照组（0.51 mg/ml）、胃肠舒小剂量组Ⅰ组（25 mg/ml）、胃肠舒中剂量组Ⅱ组（50 mg/ml）、胃肠舒大剂量组Ⅲ组（100 mg/ml）。D-Hanks液吹打6孔板中培养的胃肠平滑肌细胞，用移液枪吸取1 ml细胞悬液于1.5 ml离心管中进行Fura-2AM荧光探针的负载。胞内钙离子测定方法参考文献［7］方法，稍有改进。将细胞悬液常温离心洗涤950 r/min×5 min×3次，弃上清液。避光加入50 μl浓度为10 μmol/L（使用浓度）的Fura-2AM，37℃避光孵育负载细胞40～50 min，轻轻摇动，以加速Fura-2AM进入细胞内，实验过程中注意用铝箔包严。950 r/min离心5 min终止孵育，弃上清液。在沉淀中加入D-Hanks液，离心洗涤950 r/min×5 min×3次，洗去胞外残存的Fura-2AM，弃上清液。D-Hanks液吹打为细胞悬液进行激光扫描共聚焦显微镜检测。检测之前，吸取少量细胞悬液，滴片，加盖盖玻片。激光共聚焦显微镜下立即扫描检测（激发波长为340 nm，发射波长为510 nm）。
1.3 统计学处理 数据以x±s表示，胃肠舒各浓度组与空白对照组及西沙必利对照组间比较用方差分析，各组间两两比较。
